核酸提取、PCR、熒光定量PCR常見問題解答

*部分 核酸DNA和RNA提取常見問題分析

1.       RNAfixer的工作原理？

浸入組織，抑制RNase的活性。運輸方便，是非液氮類的一種樣品儲存液。

2.       對于內源RNase豐富的組織和樣品，如何消除RNase？

可以在提取時候多加裂解液，比如4：1等。

3.       TRIpure and RNApure區別？

胍鹽類的裂解液一樣，RNApure附加有離心柱，和漂洗液，是Kit。

TRIpure只是裂解液。

4.       凝血的gDNA和RNA的提取與新鮮血的提取不同？

需加一個分離柱（separate column）分開凝血。

5.       microRNA提取和定量？

過2次離心柱，得到200bp一下的小RNA。可以測定OD定量。

6.       血清，血漿，血液RNA提取的區別？以及Viral RNA提取的方法？

液體類樣品RNA提取用TRIpure LS。一般血清、血漿是無細胞樣品，含游離的RNA，量比較少，建議加Carrier RNA在提取時候。

病毒RNA提取加Carrier RNA在提取時候，BioTeke有專門的病毒RNA提取試劑盒。

7.       通用植物RNA提取常見問題：蛋白質污染？

DNA污染-DNaseI消化（Kit does not provide it, please get it from other companies.）

8.       真菌RNA提取

可用RNApure 或者通用植物RNA提取Kit。

9.       DNA cleanup from gel and PCR, 區別？

膠回收含有一個溶膠液。多功能膠回收可以用于膠回收和PCR產物回收。

10.    土壤DNA提取優點？

無需要機械破碎樣品和過柱的純化方式，減少DNA的鍛煉和得率，達到實驗目的。

第二部分PCR/RT-PCR常見問題解答

1.     二次PCR無目標產物，電泳孔道亮？

Template稀釋和重新設計引物

2.     microRNA的反轉錄問題？

microRNA反轉錄和普通的mRNA的反轉錄不一樣。現在常見的microRNA反轉錄引物有2種，一個是step-loop結構；另外一種是3末端加polyA后，再用oligo（dT）逆轉錄。BioTeke有microRNA提取和2-step real-time PCR Kit。

3.     cDNA的合成（RT）電泳，以及cDNA第二鏈的合成問題？

2-5uLcDNA產物電泳有模糊條帶出現。第二鏈合成也有專門的試劑盒。BioTeke現在沒有此類產品。

4.     Power Mix擴增不成功因素？

產品或者引物或者目的基因的不表達。

5.     RT-PCR沒有擴增產物?

可能是引物，模版，產品等。

第三部分Real-time qPCR 常見問題分析

1.     做標準曲線時候，可否用2個不同體系濃度的稀釋分別對于內參和目的基因？

建議用同樣稀釋倍數做曲線，因為模板濃度會影響擴增效率。

2.     熔解曲線中，Tm不出現在80度左右？

擴增片段100bp左右的，一般應該出現在80度左右。如果低于此溫度出現，可能是模板降解。

3.     擴增曲線沒有Ct值，僅僅一條斜線？什么原因？

模板濃度過低或者模板降解。

4.     如果內參和目標基因表達量差別比較大，也就是目的基因的表達量少，

   Ctcon=15，Cttarget=38，可否應用？

可以用于數據分析。因為表達量低，從而用過高模板進行擴增，從而同內標的模板不同，反而會增大數據統計的誤差。

5.     引物濃度可否是50nM，是否太低？

如果擴增曲線和熔解曲線比較好，這個濃度當然可以。如果更低，擴增結果好的情況下，同樣可以運用。

一句話，所有的模板、引物等濃度盡量不要用高的，會影響擴增效率。

6.     miRNA多個擴增時候，如果一個的擴增效果比較，其它熔解曲線不止一個峰，如何解決？

Primer對于miRNA是專一的。所以重新設計引物是不可取的。那么只能是提高Tm或者更換mastermix等。反應體系會影響反應產物的。

7.     相對定量方法，如果用Ct值比較，是各個樣品平均后在2delt Ct還是分別2 delt Ct在平均比較好？

相對定量的方法各有優缺點，主要取決于實驗的目的和材料的準備。如果是材料群體個體差異不大，這2種方法基本沒有很大的區別；如果是個體差異比較大，建議用雙標準曲線做。就是分別做內參和目的基因的標準曲線，分別帶入Ct值計算。

8.     熔解程序可否不加？

如果是擴增效果好，特異擴增，可以不加熔解程序；但建議做好加上。

9.     擴增反應體系5uL，擴增效率低，什么原因？

反應體系小，各種因素的影響比較大，比如引物濃度、模板濃度及其金屬離子等會影響擴增效率的。

10.  如何減少非特異性擴增的干擾？

設計一對好引物，提高primer的退火溫度，以及設定吸光溫度。